ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ БОЛЬНЫХ ШИЗОФРЕНИЕЙ
М. Е. Вартанян, Р. И. Раппопорт (1965)
Поиски биологической сущности шизофрении начаты задолго до выделения последней в качестве самостоятельного заболевания.
Трудности в изучении патогенеза, связанные с различным подходом исследователей к клиническому аспекту шизофрении, а также зависящие от различия методических приемов и использованных тест-объектов, неоднократно обсуждались в литературе.
В настоящее время трудно сказать, на каком из уровней исследования (нейрофизиологическом, биохимическом, эндокринологическом, гистохимическом, иммунологическом или молекулярном) шизофрения, как процесс, найдет свое специфическое отражение. Возможности изучения биологической сущности шизофрении ограничены недоступностью основного объекта исследования — головного мозга. Поэтому изучение патогенетических закономерностей болезни на уровне биологических жидкостей (кровь, ликвор, моча) организма больного может быть оправдано лишь при допущении, что в них отражаются хотя бы отдельные элементы сложной патогенетической цепи этого заболевания. Исследования, посвященные поискам материального субстрата шизофрении в биологических жидкостях, развивались в основном и двух направлениях — общебиологическом и аналитическом (биохимическом, иммунологическом и т. д.).
Каждое из этих направлений имеет как свои преимущества, так и недостатки. Изучение сыворотки больных шизофренией на биологических тест-объектах (растительных и животных) привело исследователей к заключению, что в ней имеются вещества, способные повреждать деятельность различных биологических систем в эксперименте. Это направление биологического тестирования, будучи достаточно чувствительным критерием для оценки свойств сыворотки, но своему характеру не в состоянии отразить специфичность искомого субстрата. Что касается химических и других аналитических методов для обнаружения специфических изменении в биологических жидкостях больных шизофренией, то они, являясь наиболее точными, имеют свои недостатки. В связи с этим встал вопрос о попытке применить для изучения патогенеза шизофрении синтетический метод биологической индикации, который включал бы в себя положительные стороны двух указанных выше направлений.
В Институте психиатрии АМН СССР предпринята попытка применить для изучения патогенеза шизофрении метод биологической индикации.
Указанный метод в изучении патогенеза шизофрении основан на биологическом тестировании повреждающего свойства сыворотки с дальнейшей биохимической, иммунологической, нейроэндокринологической идентификацией действующего фактора. Преимущество такого метода, по сравнению с другими, заключается в том, что он дает возможность многосторонней характеристики свойств биологических жидкостей одного и того же больного.
Другим, не менее важным, принципом явился строго дифференцированный отбор клинически однородных групп больных шизофренией. Полагая, что основные клинические проявления шизофрении (тип течения, его темп, этап, злокачественность процесса) должны отражать и какой-то степени патогенетическую сущность психоза, в клинике Института психиатрии отбирались соответствующие группы больных. При отборе клинически однородных групп больных шизофренией учитывались не тонкие психопатологические проявления болезни, а основные показатели типа течения процесса — его темп и другие.
Наиболее отличаются друг от друга в этом отношении две известные группы шизофрении: периодическая (включающая в себя циркулярную, депрессивно-параноидную формы и онейроидную кататонию), протекающая приступообразно с ремиссиями и характеризующаяся относительной доброкачественностью процесса, и ядерная (включающая в себя простую, гебефреническую и раннюю параноидную формы), протекающая злокачественно, с выраженной прогредиентностью и приводящая к значительному дефекту психики. Мы полагали, что именно эти клинические критерии могли служить наиболее адекватным выражением биологической сущности шизофрении как процесса.
По такому принципу в клинике шизофрении Института были отобраны 135 больных шизофренией. Помимо этого, с целью контроля исследовано 45 больных другими психическими заболеваниями (эпилепсия, маниакально-депрессивный психоз, болезнь Пика и другие), а также 20 здоровых добровольцев.
В настоящем докладе изложены результаты исследований, посвященных изучению действия сыворотки больных шизофренией на клетки культур тканей. Работа выполнена совместно сотрудниками лаборатории культур тканей Института вирусных препаратов (заведующий лабораторией R И. Раппопорт) и лаборатории общей патофизиологии Института психиатрии АМН СССР.
Метод культивирования тканей за последние годы получил широкое распространение и в настоящее время является ведущим во многих разделах биологии. Основное преимущество его заключается в том, что он дает возможность исследователю оперировать с живым клеточным субстратом в условиях in vitro. Другими словами, клеточные системы, полученные из соответствующих органов и тканей животных и человека, в состоянии поддерживать свое существование в определенных условиях в течение длительного времени. Мы воспользовались культурой ткани в качестве тест-объекта для изучения биологической активности сыворотки больных шизофренией. Известно, что культуры различных тканей обладают неодинаковой чувствительностью по отношению к разнообразным действующим факторам. Поэтому, прежде чем перейти непосредственно к выполнению исследования, предстояло выяснить, какой вид ткани окажется наиболее чувствительным к действию сыворотки больных шизофренией.
Из всех культур тканей чувствительными к сыворотке больных шизофренией оказались лишь фибробласты куриных эмбрионов, легкое эмбриона коровы и клетки астроцитомы.
В результате исследований установлено, что при внесении сыворотки больных шизофренией в питательную среду, окружающую ткань соответствующей культуры, эта ткань подвергалась дегенерации. Эффект повреждения наступал в среднем на 3—5 день инкубации ткани с сывороткой и выражался в полиморфной картине: изменения формы клеток, разрежение ткани, цитолиз, затем наступала стадия полного расплавления клеток ткани и были видны лишь отдельные трабекулы, соединяющие небольшое количество оставшихся клеток.
В связи с описанным эффектом возник вопрос: какой фактор, что именно в крови вызывает это цитопатическое действие в культуре ткани, какая составная часть крови является носителем повреждающего действия фактора. Для решения этого вопроса кровь дефибринировалась и разделялась на сыворотку и эритроцитарную массу. Установлено, что в сыворотке концентрация этого фактора была наиболее высокой, так как эффект вызывался при разведении 1:160, 1:320. Чтобы выяснить, не связана ли частично активность с форменными элементами крови, сделаны двух-трехкратные смывы физиологическим раствором с эритроцитов. Оказалось, что эти смывы также обладают повреждающей активностью в культуре ткани, т. е. этот фактор способен адсорбироваться посредством непрочной связи с эритроцитами больных шизофренией. При изучении химических свойств биологически активного фактора сыворотки больных шизофренией оказалось, что он термолабилен и при подогревании в течение 30 минут при 56°С инактивируется. При замораживании он выдерживает температуру +4° в течение 2—3 недель. При температуре —60° он сохраняет свою активность до 7 месяцев.
Инактивированный при температуре + 56°° этот фактор обнаружил интересное свойство: он восстанавливал свою активность при добавлении к нему соответствующего количества сыворотки здорового человека. Следовательно, для того, чтобы проявилась активность фактора, необходимо присутствие какого-то нормального белка. Исходя из этого, мы предположили, что действующий фактор представляет собой двухкомпонентную систему, состоящую из термолабильной и термостабильной частей. Очевидно, активность этого фактора связана с термостабильным компонентом, так как после инактивации прибавление обычной здоровой сыворотки вызывает его реактивацию. Можно предположить, что значение термолабильного компонента сводится к его действию как переносчика или активатора — посредника — термостабильного компонента. Из сказанного следует, что термостабильный компонент не может проявить своего повреждающего действия, если отсутствует нативный термолабильный компонент.
Но и после выявления описанных свойств сывороточного фактора природа его оставалась неясной. Следовало выяснить, к какой группе соединений, содержащихся в сыворотке, он принадлежит. Является ли он высокомолекулярной структурой типа белка или это низкомолекулярное соединение, подобное биогенным аминам, аминокислотам и их метаболитам?
С этой целью сыворотка, прежде чем внести ее в культуру ткани, была подвергнута диализу против раствора Хенкса. Другими словами, через окружающую сыворотку целлофановую мембрану удалены низкомолекулярные соединения сыворотки. Внутри диализного мешка концентрация белка на единицу объема возросла в 5 раз. Содержание белка определялось по методу Лоури. Биологическая активность отдиализованной сыворотки оказалась выше исходной, примерно, в 4 раза и проявлялась во времени на 2—3 дня раньше, Таким образом из этих экспериментов следует, что биологически активный фактор в сыворотке больных шизофренией имеет, очевидно, белковую природу.
С целью установления других свойств этого белка предпринято препаративное электрофоретическое разделение сывороточных белков на фракции альбумина, альфа-, бета-, гамма-глобулинов. При испытании цитопатической активности указанных фракций оказалось, что повреждающим действием обладала в основном бета-глобулиновая фракция и в небольшой степени альфа-глобулиновая. Альбумин и гамма-глобулин оказались неактивными. Таким образом биологически активный фактор сыворотки больных шизофренией локализован в основном в бета-глобулиновой фракции.
После установления вышеописанных свойств сывороточного фактора было интересно проследить его дальнейшую судьбу, после того как он вызывает цитопатический эффект в культуре ткани. Исчезает ли он из ткани после реализации своего действия, не инактивируется ли, не распадается ли он? Чтобы ответить на эти вопросы поставлена серия опытов, сущность которых сводилась к следующему. После того, как внесенная в культуру ткани сыворотка вызвала цитопатический эффект, т. е. клетки ткани разрушались и их содержимое, естественно, переходило в окружающую среду (культуральную жидкость), последняя забиралась и переносилась в свежую, здоровую культуру ткани. По истечении в среднем 5—6 суток и в этих клетках наступала дегенерация. Затем процедура повторялась и культуральная жидкость из погибших клеток вносилась в следующую партию здоровых клеточных культур. И в данном случае происходила такая же гибель клеток. Другими словами, несмотря на длительное время, прошедшее с момента первого внесения сыворотки в культуральную среду, действие этого фактора не ослабевало, а, наоборот (если учитывать некоторое разведение происходящее от пассажа к пассажу), несколько увеличивалось. Вначале мы полагали, что этот эффект обусловлен обычным переносом биологически активного фактора из пассажа в пассаж. Однако, в этом случае должно было происходить падение титра в культуре ткани, поскольку мы от пассажа к пассажу производили значительное разведение действующего начала. Такого падения мы не наблюдали. Больше того, при расчетах разведении внесенного исходного белка сыворотки оказывалось, что в третьем—четвертом пассаже количество исходного белка было во много раз меньше, чем количество белка, необходимое для вызывания дегенерации при первом заражении культуры. Кроме того, в нескольких опытах была предпринята попытка обнаружить в пассажах следы исходного белка (больного шизофренией), внесенного в культуру ткани первично. Методом микропреципитации по Ухтерлони между сывороткой больного шизофренией и культуральной жидкостью из 3-го пассажа не удавалось обнаружить следов сывороточного белка человека. Следовательно, предположение о том, что в феномене пассирования принимает участие белок, первично внесенный в культуру ткани вместе с сывороткой, отпадает.
Для изучения природы фактора, обеспечивающего феномен пассирования, была предпринята попытка сконцентрировать эту активность путем ультрацентрифугирования. Культуральная жидкость после возникновения цитопатического эффекта была собрана и отцентрифугирована на скоростной ультрацентрифуге при 50 000 оборотов (180 000 ж.) Затем надосадочная жидкость и осадок раздельно были внесены в культуру ткани. Оказалось, что активность пробы, взятой из осадка, в 16 раз интенсивнее (судя по разведению) нежели супернатант. Этот факт также говорит в пользу высокомолекулярной структуры действующего фактора.
Описанный феномен пассирования в наших опытах достигал 5—9 пассажей. В связи со сказанным возникает вопрос о механизме феномена пассирования. Возникают три предположения: 1) эффект пассирования может быть обусловлен самовоспроизведением живого начала;
2) эффект пассирования может быть связан с активацией собственных вирусов фибробластов куриного эмбриона;
3) эффект пассирования может быть связан с внесением в клетку фибробласта чужеродной генетической информации и дальнейший эффект дегенерации обусловлен изменением в генетическом аппарате клетки.
В настоящее время эти предположения проверяются нами экспериментально. Полученные результаты позволили
нам сделать предварительное заключение, что при действии сыворотки больных шизофренией на культуры фибробластов куриного эмбриона в цитоплазме клетки происходит накопление рибонуклеиновых кислот.