НЕКОТОРЫЕ ПРОБЛЕМЫ ПОИСКА ЭНДОГЕННЫХ ЛИГАНДОВ ИМИПРАМИНОВЫХ И БЕНЗОДИАЗЕПИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ

М. Вартанян, А. Мухин, В. Демушкин, О. Брусов (1986)

ВВЕДЕНИЕ

Очистка и химическая идентификация эндогенных лигандов к имипраминовым и бензодиазепиновым «рецепторам» является основной ступенью в реализации поиска возможных биологически активных имипрамино- и бензодиазепиноподобных субстанций. На сегодняшний день, однако, накопленный опыт поиска таких лигандов выявил целый ряд методологических проблем. Эти проблемы связаны в основном с 1) существованием большого числа соединений в биологических тканях, которые ингибируют специфическое связывание ЗН-бензодиазепина (ЗН-BZ) и ЗН-имипрамина (3H-IMI), 2) возможностью артефактной генерации BZ-подобных и IMI-подобных ингибиторов в процессе очистки, 3) гетерогенностью мест специфического связывания ЗН-IMI.

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ЛИГАНДОБ К BZ И IM1 «РЕЦЕПТОРАМ»

Чтобы выявить связана или нет ингибиторная активность кислотного экстракта мозга коровы с одной или несколькими субстанциями мы разработали метод разделения экстракта, полученного после ультрафильтрации (точка отсечения фильтра — 5000 дальтон) на сефадексе G-10. После хроматографии экстракта были обнаружены 7 пиков, обладающих ингибиторной активностью ня связывание 3H-BZ. 4 пика имели свойства конкурентного ингибитора и не инактивировались проназой. Дальнейшая очистка фракций методом ВЭЖХ привела к увеличению числа фракций, обладающих такой ингибиторной способностью. При этом, первый пик содержал 4 активные фракции, второй и третий — по одной активной фракции. Четвертый пик содержал 2 активные фракции. УФ- и масс-спектрометрия второго и третьего пиков после ВЭЖХ с внутренними стандартами привела к заключению, что ингибиторные свойства пиков являются следствием присутствия, в фракциях инозина и гипоксантина, соответственно, Анализ первого и четвертого пиков был затруднен вследствие их гетерогенности и малого количества материала. Было выявлено присутствие около 20 УФ-пиков после ВЭЖХ на обратно фазной колонке (нуклеосил С 18) первого пика, Ингибиторная активность этого пика связана с 4-я группами этих УФ-пиков.

Плазма крови человека, тромбоциты крови человека и мозг крысы также содержат значительное количество низко молекулярных ингибиторов обратного захвата серотонина (5-окситриптамина, 5-ОТ) и специфического связывания имипрамина. Ингибиторы из экстракта плазмы крови человека инактивировались при их обработке лейцинаминопептидазой, но были резистентны к обработке нейроминидазой или фосфолипазами А, С и Д. Таким образом, было предположено, что эти ингибиторы имеют частично пептидную природу. Профиль элюции экстракта из плазмы крови человека после хроматографии на биогеле Р-2 выявил 2 больших пика, ингибирующих обратный захват 5-ОТ и специфическое связывание 3H-IMI — т. е. проявляли свойства, наиболее важные в поиске эндогенных лигандов IMI «рецепторов». Хроматография меченого по тритию серотонина в тех же условиях показала, что он выходит весь только с первым пиком.

Кроме того, Хроматография экстракта плазмы крови человека показала присутствие 3 добавочных пиков, обладающих способностью ингибировать обратный захват 5-ОТ, но не способных ингибировать специфическое связывание 3H-IM1 — факт, открывающий возможность идентификации эндогенных лигандов с антидепрессивными свойствами и не обладающими ингибиторными свойствами в отношении связывания 3H-IMI.

Может возникнуть вопрос, связана ли выявленная гетерогенность ингибиторов 3H-IMI и 3H-BZ связывания с реальной их гетерогенностью или эти ингибиторы имеют артефактное происхождение?

ВОЗМОЖНОСТЬ АРТЕФАКТНОЙ ГЕНЕРАЦИИ BZ-ПОДОБНЫХ И 1М1-ПОДОБНЫХ ИНГИБИТОРОВ В ПРОЦЕССЕ ОЧИСТКИ

Поиск эндогенных лигандов IMI-рецепторов непептидного происхождения позволил нам высказать предположение о том, что продукты конденсации катехоламинов и индоламинов с альдегидами могут быть потенциальными лигандами IMI-рецепторов. Поэтому мы пришли к заключению, что часть выявленных не-пептидных ингибиторов специфического связывания IMI подобных бета-каболинам или изохинолинам, которые также ингибируют связывание BZ, возможно имеют артефактную природу. Что исключить артефактную генерацию таких ингибиторов мы разработали методику мягкой одноступенчатой экстракции тканей в 1М НСL и5% ТФУ с 0,1 тМ семикарбазидов (специфический «поглотитель» альдегидов). Экстракт наносили на предколонку типа Sep-Pack CIS (Millipore Corp.) уравновешенной в 5 % ТФУ. Следующая стадия включала ВЭЖХ на колонке с сорбентом типа Nova-pack C18 (Millipore Corp.). Однако, чтобы точно определить артефактное происхождение ингибитора необходимо также выявить его физиологическое значение. Необходимо также отметить, что артефактная генерация IMI-или BZ-подобных ингибиторов может иметь место вследствие возможной фрагментации пептидных цепей в процессе очистки.

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ МЕСТ СПЕЦИФИЧЕСКОГО СВЯЗЫВАНИЯ 3H-IMI

Одной из возможной причин, объясняющих отсутствие тесной корреляции между связывающей активностью IMI рецепторов к антидепрессантам и их фармакологической эффективностью, является гетерогенность этих рецепторов. Мы показали, что химическая модификация SH-групп, находящихся в связывающем участке IMI-рецептора только частично (на 50 %) уменьшает способность этого рецептора связывать ЗН-IMI. Анализ Скэтчарда показал, что величины Kd для контрольных и модифицированных мембран достоверно (Р>0,05) не различаются, тогда как значения Вmax, для связывания 3H-IMI на модифицированных мембранах снижены на 50 % (Р<0,05). Это свидетельствует о существовании 2-х типов химически различных мест специфического связывания имипрамина.

Литературные данные также свидетельствуют о гетерогенности IMI-рецепторов, так как анализ Скэтчарда в области концентраций 3H-IMI — 0,1 — 250 нМ выявил вогнутый (бифазный) характер кривой. При этом кажущиеся значения величин Kd для высоко- и низко-аффинных мест специфического связывания 3H-IMI оказались равными 0,68 и 29,3 нМ, соответственно. Эти результаты показывают сложный характер связывания 3H-IMI со своими рецепторами на тромбоцитах крови человека. Подобные результаты получены и на ткани мозга крыс. Принимая во внимание различную натриевую зависимость высоко- и низкоаффинных мест специфического связывания 3H-IMI мы показали, что высокоаффинное связывание 3H-IMI может быть определено как разница в связывании 3H-IMI в присутствие и отсутствие 120 мМ NaCL в инкубационной пробе. Анализ Скэтчарда выявляет при этом высокоаффинную составляющую как прямую линию с Kd приблизительно равной высокоаффинной составляющей в бифазной сатурационной кривой. Низкоаффинное связывание 3H-IMI при этом определяется как разность между специфическим связыванием 3H-IMI в 50 мМ трис буфере рН 7,6. содержащем 5 мМ KCL и тем же буфером, содержащем 120 мМ Lid (вместо 120 мМ NaCL). При анализе Скэтчарда низкоаффинное связывание 3H-IMI выявляется в виде прямой линии с Kd равным низкоаффинной части бифазной кривой. Такой анализ улучшает также точность определения высоко- и низкоаффиных параметров связывания 3H-IMI.

Таким образом, дальнейший поиск эндогенных лигандов IMI-рецепторов требует выявления субтипов связывающих мест, через которые проявляются фармакологические эффекты IMI.

Сложный характер специфического связывания 3H-IMI не удивителен в свете данных о большом количестве различных типов рецепторов, связывающихся с трициклическими антидепрессантами, среди которых наиболее важные — альфа-адренергические, гистиминергические, мускариновые и опиатные.

Однако еще остаются сомнения в возможности существования эндогенных лигандов для субтипов 1М1-«рецепторов». Для этого необходима детальная характеристика всех известных антидепрессантов на предмет составления их сравнительных «карт» связывания с этими субтипами рецепторов, из которых возможно будет составить представление о биохимической и фармакологической значимости этих «рецепторов». Сейчас, однако, необходимо отметить, что низкоаффинные места специфического связывания 3H-IMI являются единственными местами специфического связывания всех известных типов антидепрессантов в концентрациях наблюдаемых при их клиническом применении. Этот факт требует раздельного определения способности возможных эндогенных лигандов вытеснять 3H-IMI из высоко- и ниэкоаффинных мест его специфического связывания. Для выяснения этих вопросов требуется дальнейшая работа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ современной литературы и наши собственные данные привели нас к заключению, что для дальнейшего поиска эндогенных лигандов BZ- и 1М1-«рецепторов» необходимо значительное улучшение качества очистки этих лигандов и методов анализа их связывания с различными «рецепторами».